Počas môjho pobytu v dňoch 2. 8. 2010 – 31.8.2010 v National Institute of Crop Science, NARO, Tsukuba, Japonsko, som sa sústredil na identifikáciu rozdielne exprimovaných proteínov a fosfoproteínov hospodársky veľmi významnej plodiny – sóje za stresových podmienok.

Na naše experimenty slúžili dvojdňové klíčky sóje, ktoré sa zatopili na 24h. Päť milimetrov dlhé špičky korienkov sa následne odstrihli, zozbierali z kontrolných a aj zatopených klíčkov a následne sa z nich analyzovali proteíny v biologických triplikátoch. Proteíny sa purifikovali metódov chloroform-metanol a analyzovali Shot-gun proteomickým prístupom. Na amotnú analyze sa použila kvapalinová chromatografia s následnou fragmentačnou hmotnostnou spektrometriou (LC-MS/MS) za využitia LTQ-Orbitap s rozlíšením 60,000 FWHM.

Komplexná identifikácia fosfoproteínov vyžaduje ich obohatenie v zmesi. Naučil som sa techniky obohatenia fosfoproteínov použitím afinitnej chromatografie s imobilizovaným kovom (Qiagen) a fosfopeptidov s TiO2 Mag Sepharózou (GE Healthcare). Obohatenie fosfoproteínov použitím Qiagen kolóny sme sledovali s SDS-PAGE.

S cieľom určiť rozdiely vo fosforilácii proteínov, obohatená frakcia proteínov sa poštiepila trypsínom a analyzovala s LC-MS/MS technikou.

Keďže pri kolízne indukovanej disociácii fosfoproteínov dochádza zväčša k neutrálnej strate kyseliny fosforečnej a generované hmotnostné spektra obsahujú len málo informatívnych iónov, naučil som sa manipulovať process iónovej disociácie, aby sme vyprodukovali spektra s informatívnou hodnotou.

Tento postup viedol k identifikácii viac ako 150 fosfoproteínov izolovaných z koreňových špičiek sójových klíčkov s rôznymi miestami fosforylácie. Dosiahnuté výsledky a postupy som prezentoval na 2 seminároch, ktoré sa konali 27. augusta 2010 o 13:30 a 17:00h.

Vzhľadom na to, že naše pracovisko sa venuje hmotnostnej spektrometrii a proteomike, absolvovaná služobná cesta bola značným prínosom a umožnila získať nové poznatky v uvedenej oblasti, ktoré následne budú využité pri našich experimentoch.